稀疏解卷積：實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞超分辨率熒光顯微成像的“新利器”

超分辨率熒光顯微成像技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，但在活細(xì)胞成像時(shí)也面臨著一系列挑戰(zhàn)。北京大學(xué)陳良怡教授團(tuán)隊(duì)與哈爾濱工業(yè)大學(xué)李浩宇教授團(tuán)隊(duì)合作提出稀疏解卷積算法，克服熒光顯微鏡的物理分辨率極限，實(shí)現(xiàn)通用的分辨率提升。該算法在活細(xì)胞成像應(yīng)用與實(shí)踐過(guò)程中，實(shí)現(xiàn)了約60納米空間分辨率的毫秒曝光或者多色、三維、長(zhǎng)時(shí)間的超分辨率熒光顯微成像，同時(shí)該算法還能與現(xiàn)有多數(shù)商業(yè)熒光顯微鏡結(jié)合應(yīng)用，可謂是實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞超分辨率熒光顯微成像的“新利器”。

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現(xiàn)代科技和生物醫(yī)學(xué)的交叉融合推動(dòng)著臨床醫(yī)學(xué)的理念革新和技術(shù)進(jìn)步。光學(xué)顯微鏡作為一種成像儀器，長(zhǎng)期以來(lái)一直為精密制造和生命科學(xué)等領(lǐng)域的定性與定量分析和研究提供著有效而關(guān)鍵的支撐。2014年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予了美國(guó)科學(xué)家埃里克?貝齊格、威廉?莫納和德國(guó)科學(xué)家斯特凡?黑爾，以表彰他們?yōu)榘l(fā)展超分辨率熒光顯微鏡所作的貢獻(xiàn)。他們利用控制熒光分子特性的方式，克服了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡分辨率受限于光學(xué)衍射極限的問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)了“熒光超分辨”成像。借助這種新興的生物醫(yī)學(xué)影像工具，研究人員可對(duì)生物體乃至細(xì)胞內(nèi)部不同結(jié)構(gòu)成分及其相互作用進(jìn)行觀察分辨，這也使得動(dòng)態(tài)記錄生命活體或者活細(xì)胞中的精細(xì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)變化成為可能。

迄今為止，基于光學(xué)硬件或者熒光探針的改進(jìn)方案，都無(wú)法進(jìn)一步使活細(xì)胞超分辨率熒光顯微成像提升到毫秒尺度60納米的時(shí)空分辨率。例如，非線性結(jié)構(gòu)光顯微鏡（Structured Illumination Microscopy, SIM）雖可實(shí)現(xiàn)接近60納米的空間分辨率，但需以降低時(shí)間分辨率為代價(jià)，且需使用光漂白敏感的可光活化/光開(kāi)關(guān)熒光蛋白。此外，由于細(xì)胞深層內(nèi)部的分辨率和對(duì)比度仍然受到熒光發(fā)射和離焦平面散射的影響，高對(duì)比度超分辨率結(jié)構(gòu)光顯微成像的成像深度只能被限制在0.1～1微米。因此，當(dāng)前亟待找尋一種超分辨率方法，能夠在活細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)約60納米空間分辨率的毫秒曝光或者進(jìn)行多色、三維、長(zhǎng)時(shí)間的超分辨率熒光顯微成像。

稀疏解卷積算法

應(yīng)用與實(shí)踐

由稀疏解卷積算法與商用的轉(zhuǎn)盤共聚焦結(jié)構(gòu)光顯微鏡（SD-SIM）結(jié)合得到的稀疏SD-SIM（Sparse SD-SIM），能夠以優(yōu)于90納米的分辨率實(shí)現(xiàn)多色、三維、長(zhǎng)時(shí)間的活細(xì)胞超分辨率熒光顯微成像。合作團(tuán)隊(duì)使用雙色稀疏SD-SIM在活細(xì)胞中觀測(cè)到了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與溶酶體接觸的事件。稀疏SD-SIM還可進(jìn)行四色超分辨率成像，能夠在活細(xì)胞中同時(shí)觀測(cè)溶酶體、線粒體、微管和細(xì)胞核的動(dòng)態(tài)圖像（見(jiàn)圖4）。類似地，合作團(tuán)隊(duì)在活體COS-7細(xì)胞的軸線上觀察到細(xì)胞核、線粒體和微管的三維圖像，并進(jìn)行了三色成像，如圖5（a）所示。經(jīng)過(guò)稀疏解卷積優(yōu)化后，微管成像點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（PSF）的軸向半高寬（FWHM）從465納米降低到228納米，如圖5（b）所示。此外可以觀察到，在一些軸向面被微管絲和線粒體侵入的區(qū)域，連續(xù)的、凸?fàn)畹暮私Y(jié)構(gòu)向內(nèi)彎曲變成凹狀，如圖5（c）所示。這種相互作用的變化表明微管蛋白網(wǎng)絡(luò)可能會(huì)影響細(xì)胞核的組裝和形態(tài)。

合作團(tuán)隊(duì)提出的稀疏解卷積算法是一種實(shí)現(xiàn)計(jì)算超分辨率熒光顯微成像的全新方法，而與基于特定物理原理或特殊熒光探針的超分辨率方法都不相同。通過(guò)實(shí)際的生物樣本實(shí)驗(yàn)量化，稀疏解卷積算法被證明能夠?qū)崿F(xiàn)接近2倍穩(wěn)定的空間分辨率提升，而不需要付出額外的硬件代價(jià)。稀疏解卷積算法與超快超分辨率結(jié)構(gòu)光顯微鏡系統(tǒng)結(jié)合形成的稀疏SIM，更是目前活細(xì)胞光學(xué)成像中有著最高分辨率、最快速度、最長(zhǎng)成像時(shí)間的超分辨率光學(xué)顯微成像手段，可用于觀察活細(xì)胞中囊泡分泌孔道和新中間態(tài)，辨識(shí)線粒體內(nèi)嵴及其動(dòng)態(tài)過(guò)程，記錄不同蛋白標(biāo)記的核孔復(fù)合體與小窩蛋白環(huán)狀結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)過(guò)程。此外，稀疏解卷積算法具備較好的通用性，可與現(xiàn)有多數(shù)商業(yè)熒光顯微鏡進(jìn)行結(jié)合應(yīng)用，有效提升其空間分辨率，從而使其能夠觀察到更清楚的精細(xì)結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)。

未來(lái)，合作團(tuán)隊(duì)將進(jìn)一步開(kāi)發(fā)相關(guān)軟件、數(shù)據(jù)庫(kù)和工程化硬件平臺(tái)，同時(shí)開(kāi)展相關(guān)成果的產(chǎn)業(yè)化推廣工作，以期早日為神經(jīng)生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳生物學(xué)、移植生物學(xué)等研究及臨床應(yīng)用提供更為高效的活體影像工具。