一種新型ATP食品衛(wèi)生檢測(cè)儀的研制

1、引言

食品安全是一個(gè)直接關(guān)系到人民群眾生命健康和社會(huì)穩(wěn)定的重大公共安全問題，而細(xì)菌性污染又是其中極為重要的因素。如何能夠快速、有效的檢測(cè)食品中細(xì)菌的含量，是當(dāng)今食品安全必然涉及的技術(shù)課題。目前檢測(cè)細(xì)菌含量的主要方法如下：

（1）傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測(cè)方法：傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測(cè)被稱為“金標(biāo)方法”，但其培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)且對(duì)檢測(cè)條件以及檢測(cè)人員的專業(yè)水平要求較高。

（2）ATP(三磷酸腺苷)生物化學(xué)發(fā)光法：利用細(xì)胞的特征來(lái)測(cè)定細(xì)菌數(shù)，是快速檢測(cè)菌落總數(shù)的一個(gè)發(fā)展方向。這種方法可以在幾分鐘內(nèi)得出結(jié)果，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間。

（3）其他檢測(cè)方法：除了上述兩種檢測(cè)方法外，還有許多檢測(cè)方法正在迅速發(fā)展。其中包括免疫學(xué)方法，分子生物學(xué)方法以及其他生物化學(xué)方法[1]。這些檢測(cè)方法各有千秋，但許多檢測(cè)方法或因設(shè)備試劑比較昂貴、或因操作過程復(fù)雜、或因?qū)嶒?yàn)條件較為嚴(yán)格，不適用于食品衛(wèi)生狀況的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

可見ATP生物化學(xué)發(fā)光法具有極大的優(yōu)點(diǎn)。但是目前大部分ATP衛(wèi)生檢測(cè)儀采用了光電倍增管（PMT）作為熒光探測(cè)器[2-3]，閃光型熒光素酶作為檢測(cè)試劑，導(dǎo)致體積較大，價(jià)格昂貴，僅適合實(shí)驗(yàn)室的驗(yàn)證工作，極大的限制了其在食品生產(chǎn)衛(wèi)生檢測(cè)過程中的應(yīng)用。為了克服其缺點(diǎn)，本文采用新型硅光電二極管作為熒光探測(cè)器，輝光型熒光素酶作為檢測(cè)試劑，設(shè)計(jì)出一種新型的ATP食品衛(wèi)生檢測(cè)儀，具有便攜性、功耗低、高靈敏度和速度快的優(yōu)點(diǎn)。

2、ATP生物化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方案

2.1 ATP生物化學(xué)發(fā)光檢測(cè)原理

ATP是包括微生物在內(nèi)的一切活生物細(xì)胞能量的來(lái)源。它在蟲熒光素酶的催化作用下，與熒光素在有氧環(huán)境及二價(jià)鎂離子的作用下釋放出熒光，其反應(yīng)式為[4]：

強(qiáng)度呈線性關(guān)系，用光度計(jì)測(cè)出發(fā)光強(qiáng)度，也就得到了細(xì)菌總數(shù)[5]。這種方法可以在幾分鐘內(nèi)得到結(jié)果，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間。

2.2 ATP生物發(fā)光酶的選擇

當(dāng)前商業(yè)化的ATP螢火蟲熒光素-蟲熒光素酶主要分為閃光型和輝光型兩種：

（1）閃光型（Flash） 光在幾秒鐘內(nèi)就能發(fā)射完。發(fā)光過程中光強(qiáng)很快到達(dá)峰值然后迅速下降（1-3s）[2]。

（2）輝光型（Glow） 有些商業(yè)化的熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)采用特殊的方法，使得酶的活性高，產(chǎn)生的光強(qiáng)度強(qiáng)，在測(cè)試的幾分鐘之內(nèi)可以保持穩(wěn)定。

由于閃光型發(fā)光持續(xù)時(shí)間短，對(duì)此類型光進(jìn)行測(cè)試必須要采用自動(dòng)加樣系統(tǒng)，這使得檢測(cè)儀的體積增大，攜帶不方便，不利于對(duì)食品生產(chǎn)環(huán)境進(jìn)行實(shí)時(shí)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。本文采用輝光型酶作為檢測(cè)試劑，只要在兩分鐘之內(nèi)對(duì)試樣檢測(cè)即可，不需要自動(dòng)加樣系統(tǒng)克服了閃光型酶的缺點(diǎn)。

3、系統(tǒng)設(shè)計(jì)

3.1 硬件設(shè)計(jì)

儀器的硬件部分主要由取樣測(cè)試室、電源模塊、微弱熒光檢測(cè)模塊、校準(zhǔn)模塊、單片機(jī)控制模塊、通信模塊和人機(jī)對(duì)話模塊等部分組成。儀器硬件結(jié)構(gòu)如圖1所示。

此測(cè)試儀在設(shè)計(jì)過程中面臨的兩個(gè)突出的難點(diǎn)在于儀器近乎苛刻的超低功耗要求和對(duì)超微弱熒光的檢測(cè)。針對(duì)這兩點(diǎn)，本文對(duì)電源模塊和微弱熒光檢測(cè)模塊采取如下設(shè)計(jì)方案。

（1）電源模塊 由于儀器的便攜特性，采用兩節(jié)普通的1.5V堿性電池作為儀器的電源。利用具有電池反接保護(hù)功能的升壓開關(guān)電源芯片MAX1833，將電池電壓轉(zhuǎn)化整個(gè)硬件系統(tǒng)的3.3V工作電壓，和最大150mA的電流輸出。此芯片靜態(tài)電流為4μA，關(guān)斷電流小于1μA，電源轉(zhuǎn)換效率高達(dá)90%。

微弱熒光檢測(cè)模塊需要精度和穩(wěn)定性要求更高的電源供電，本文選用美國(guó)國(guó)家半導(dǎo)體公司生產(chǎn)的低壓差線形穩(wěn)壓芯片LP2982，可提供精準(zhǔn)的3V電壓和最大50mA的電流輸出，具有輸出電壓精度1%，低噪聲和關(guān)斷電流小于1μA等特點(diǎn)。電源模塊電路如圖2所示。

以上供電模塊的設(shè)計(jì)，具有電源轉(zhuǎn)換效率高，靜態(tài)漏電流低等優(yōu)點(diǎn)。計(jì)算證明這樣的設(shè)計(jì)可使儀器待機(jī)長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月。

（2）微弱熒光檢測(cè)模塊 傳統(tǒng)ATP檢測(cè)儀采用PMT作為光電傳感器，對(duì)試樣所發(fā)出的熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)。由于PMT工作時(shí)需要正負(fù)高壓電源供電，使得用其作為光電探測(cè)器的衛(wèi)生檢測(cè)儀體積較大且價(jià)格昂貴，不方便攜帶，極大的限制了此種檢測(cè)儀的應(yīng)用。本文采用日本濱松生產(chǎn)的s1227系列硅光電二極管作為光電傳感器，具有體積較小，靈敏度高，暗電流小等優(yōu)點(diǎn)。與PMT相比，硅光電二極管本身沒有電流的放大作用，因此需要設(shè)計(jì)良好的放大電路將光電二極管輸出的微弱電流進(jìn)行放大。本文采取以下兩種措施，很好的解決了微弱電流信號(hào)的放大問題：

① 選用高性能的集成運(yùn)算放大器 本文采用ADI公司生產(chǎn)的AD8605運(yùn)算放大器芯片作為放大器。此放大器具有偏置電壓低，輸入電流低（pA級(jí)），電壓電流噪聲低等優(yōu)點(diǎn)，是光電二極管放大電路的最佳選擇。光電二極管采用光伏模式，可以非常精確的線性工作，無(wú)暗電流，整個(gè)電路的噪聲低。

② 對(duì)整個(gè)微弱熒光檢測(cè)模塊進(jìn)行屏蔽 本文采用的特殊設(shè)計(jì)的鋁殼進(jìn)行屏蔽的方法取得了很好的效果。信號(hào)放大后，由具有16位Δ-ΣA/D轉(zhuǎn)換器的MAX1407數(shù)據(jù)采集芯片進(jìn)行采樣。整個(gè)信號(hào)調(diào)理電路如圖3所示。

此外，放大器的增益漂移也是一個(gè)必須考慮的問題。本文設(shè)計(jì)了校準(zhǔn)模塊來(lái)解決此問題：

光電二極管內(nèi)阻和反饋電阻R的溫度特性會(huì)導(dǎo)致整個(gè)電路的放大倍數(shù)隨著溫度而變化。本文采用綠光LED（發(fā)射出560nm左右的光，與ATP生物化學(xué)發(fā)光光譜非常匹配）作為校準(zhǔn)光源來(lái)解決此問題。LED發(fā)光具有穩(wěn)定的低漂移，在一定范圍內(nèi)發(fā)光強(qiáng)度與電流成正比。設(shè)電流為I1，I2為通過LED的電流，放大電路輸出電壓分別為V1，V2，利用公式（1）：

可以計(jì)算出當(dāng)前環(huán)境下的放大系數(shù)β，與標(biāo)準(zhǔn)放大倍數(shù)相乘就可以得到當(dāng)前放大倍數(shù)。此校準(zhǔn)模塊，具有自動(dòng)校準(zhǔn)的特點(diǎn)，不需要人工干預(yù)。

采用6鍵簿膜開關(guān)作為儀器的輸入部分，輸出部分為字符型LCD。具有打印接口以及與上位機(jī)進(jìn)行通信的RS232接口。按鍵少，界面友好，操作簡(jiǎn)單。

3.2 軟件設(shè)計(jì)

由于整個(gè)系統(tǒng)功能比較復(fù)雜，為了充分利用系統(tǒng)的硬件資源，方便對(duì)程序的管理以及升級(jí)，儀器采用μC/OS-II嵌入式操作系統(tǒng)管理整個(gè)軟件系統(tǒng)。整個(gè)軟件系統(tǒng)采用三層結(jié)構(gòu)，由內(nèi)向外分別是操作系統(tǒng)層、應(yīng)用層、硬件層，如圖4所示。

應(yīng)用層是依據(jù)系統(tǒng)的基本功能以及對(duì)硬件的依賴來(lái)劃分的。主要有以下五個(gè)任務(wù)：信號(hào)采集處理任務(wù)、命令處理任務(wù)、顯示任務(wù)、數(shù)據(jù)存儲(chǔ)任務(wù)和通信任務(wù)。根據(jù)自身的性質(zhì)和對(duì)實(shí)時(shí)性要求的不同，應(yīng)對(duì)這五項(xiàng)任務(wù)分配不同的優(yōu)先級(jí)。

（1）信號(hào)采集處理任務(wù) 控制MAX1407對(duì)試樣的發(fā)光值進(jìn)行采樣并對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。是整個(gè)系統(tǒng)的核心，在本系統(tǒng)中具有最高優(yōu)先級(jí)。平時(shí)處于掛起狀態(tài)，由命令處理任務(wù)激活,數(shù)據(jù)采集完成后，激活數(shù)據(jù)存儲(chǔ)任務(wù)，然后掛起。

（2）命令處理任務(wù) 根據(jù)鍵值和系統(tǒng)當(dāng)前所處狀態(tài)激活其他任務(wù)，任務(wù)優(yōu)先級(jí)較高，在本系統(tǒng)中處于第二優(yōu)先級(jí)。

（3）顯示任務(wù) 在LCD上實(shí)時(shí)顯示各種數(shù)據(jù)及狀態(tài)，任務(wù)優(yōu)先級(jí)較高，為第三優(yōu)先級(jí)。

（4）數(shù)據(jù)存儲(chǔ)任務(wù) 通過SPI總線與25AA640芯片進(jìn)行通信，存儲(chǔ)檢測(cè)數(shù)據(jù)。

（5）通信任務(wù) 與上位機(jī)通信，傳送檢測(cè)數(shù)據(jù)或接收上位機(jī)命令。

系統(tǒng)運(yùn)行時(shí)，首先進(jìn)行系統(tǒng)初始化操作，即初始化所有數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)，分配堆?？臻g，然后建立任務(wù)間通信的信號(hào)量或者消息郵箱，進(jìn)而創(chuàng)建任務(wù)，所有任務(wù)被置于就緒態(tài)。多任務(wù)環(huán)境開始運(yùn)行，命令處理任務(wù)根據(jù)鍵盤狀態(tài)激活其他任務(wù)，從而實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)的各個(gè)功能。

4、測(cè)量結(jié)果與分析

常見的微生物如真菌類，其ATP含量的數(shù)量級(jí)為10-11mol/細(xì)胞，細(xì)菌類為10-18mol/細(xì)胞[5]。根據(jù)食品生產(chǎn)過程中對(duì)環(huán)境衛(wèi)生的要求，本儀器的設(shè)計(jì)目標(biāo)是能夠準(zhǔn)確檢測(cè)10-15-10-11mol的ATP。當(dāng)ATP的量在此范圍時(shí)，儀器應(yīng)該具有良好的重復(fù)性和線性。

為了測(cè)試儀器的性能，采用美國(guó)普洛麥格公司生產(chǎn)的輝光型熒光素-熒光素酶作為檢測(cè)試劑，將配置的不同量的ATP標(biāo)準(zhǔn)液（10-16-10-7mol）加入到螢火蟲-熒光素酶中，用儀器進(jìn)行測(cè)量。為了避免偶然性，對(duì)不同數(shù)量級(jí)的ATP量進(jìn)行多次試驗(yàn)。將測(cè)到的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，繪制不同物質(zhì)的量的ATP與發(fā)光值的對(duì)應(yīng)曲線如圖5所示：

可以看出，發(fā)光曲線明顯的分為三個(gè)部分，下面分別對(duì)這三個(gè)部分進(jìn)行分析：

（1）區(qū)域A 此部分發(fā)光量隨ATP量的增加而稍微增加但不成線性關(guān)系。這是因?yàn)閮x器和酶存在背景噪聲，當(dāng)ATP的量很小時(shí)，發(fā)出的光十分微弱，被背景噪聲淹沒。

（2）區(qū)域B 在此區(qū)域內(nèi)發(fā)光量與ATP的量成7個(gè)數(shù)量級(jí)的線性關(guān)系。因此，可以用發(fā)光值作為評(píng)判ATP量的方法之一。

（3）區(qū)域C 在此區(qū)域內(nèi)的ATP量大，而參與反應(yīng)的酶的含量一定，造成ATP剩余，發(fā)光量漸趨飽和。

由測(cè)量曲線可以得出，本文所設(shè)計(jì)的ATP食品衛(wèi)生檢測(cè)儀在檢測(cè)10-15-10-11mol量的ATP時(shí)，具有良好的線性和可重復(fù)性，達(dá)到了設(shè)計(jì)要求。因此，本檢測(cè)儀可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌含量的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

5、結(jié)論

本儀器采用ATP生物化學(xué)發(fā)光法與嵌入式系統(tǒng)相結(jié)合的方法，使得對(duì)微生物含量的檢測(cè)時(shí)間大大縮短，只需要兩分鐘即可得到測(cè)試結(jié)果。特別由于采用硅光電二極管作為光電傳感器，解決了通常使用PMT光電倍增管體積大，價(jià)格昂貴，不方便攜帶的缺點(diǎn)。測(cè)試儀的體積小，方便攜帶，功耗低，待機(jī)時(shí)間長(zhǎng)，檢測(cè)精度高，能夠方便的對(duì)試樣進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，在食品生產(chǎn)衛(wèi)生檢測(cè)領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景。