Nat Commun：利用CRISPR-Cas9繪制DNA突變

在一項(xiàng)新的研究中，來(lái)自美國(guó)弗吉尼亞聯(lián)邦大學(xué)的Jason Reed博士和同事們開發(fā)出一種新的納米繪圖(nanomapping)技術(shù)，這可能引發(fā)致病性基因突變?cè)\斷和發(fā)現(xiàn)方法變革。這種新技術(shù)將高速原子力顯微鏡(AFM)與一種基于CRISPR的化學(xué)條形碼技術(shù)結(jié)合起來(lái)，幾乎與DNA測(cè)序那樣準(zhǔn)確地繪制DNA圖譜，同時(shí)更快地處理大片段的基因組。更重要的是，這種技術(shù)能夠由在普通的DNA播放器中發(fā)現(xiàn)的部件供電。相關(guān)研究結(jié)果于2017年11月21日在線發(fā)表在Nature Communications期刊上，論文標(biāo)題為“DNA nanomapping using CRISPR-Cas9 as a programmable nanoparticle”。

人類基因組由數(shù)十億個(gè)DNA堿基對(duì)組成。一旦松散開來(lái)，它長(zhǎng)將近6英尺。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生分裂時(shí)，它們必須為新的細(xì)胞拷貝它們的DNA。然而，有時(shí)這種DNA的多種片段被錯(cuò)誤地拷貝或者在錯(cuò)誤的位點(diǎn)連接在一起，從而產(chǎn)生導(dǎo)致癌癥等疾病的基因突變。DNA測(cè)序是如精確以至于它能夠分析DNA的單個(gè)堿基對(duì)。但是為了分析大片段的基因組來(lái)發(fā)現(xiàn)基因突變，技術(shù)人員必須確定數(shù)百萬(wàn)個(gè)微小的序列，然后利用計(jì)算機(jī)軟件將它們拼接在一起。相反之下，諸如熒光原位雜交(FISH)之類的生物醫(yī)學(xué)成像技術(shù)僅能夠在幾萬(wàn)個(gè)堿基對(duì)的分辨率下分析DNA。

Reed的這種新的高速AFM方法能夠在數(shù)十個(gè)堿基對(duì)的分辨率下繪制DNA圖譜，同時(shí)創(chuàng)建分辨率高達(dá)一百萬(wàn)個(gè)堿基對(duì)的圖片。而且它使用的樣品數(shù)量?jī)H是DNA測(cè)序所需的一小部分。

Reed說(shuō)，“DNA測(cè)序是一種強(qiáng)大的工具，但是它仍然具有高昂的成本，并有一些技術(shù)和功能上的局限性，從而使得難以高效地和準(zhǔn)確地繪制出大片段的基因組。我們的方法填補(bǔ)了DNA測(cè)序和其他的分辨率較低的物理圖譜技術(shù)之間的差距。它能夠作為一種獨(dú)立的方法加以使用，也能夠作為DNA測(cè)序的補(bǔ)充，降低在DNA測(cè)序過(guò)程中將小片段的基因組拼接在一起時(shí)的復(fù)雜性和錯(cuò)誤。”

AFM通過(guò)它的微針(microscopic stylus)與被研究的材料的表面相接觸來(lái)繪制出這種材料表面的圖片。然而，傳統(tǒng)的AFM對(duì)醫(yī)學(xué)應(yīng)用來(lái)說(shuō)太慢了，因此，它主要由材料科學(xué)的工程師使用。

Reed說(shuō)，“我們的設(shè)備與AFM的工作方式相同，但是讓樣品以更大的速度經(jīng)過(guò)這種微針，并且利用光學(xué)儀器檢測(cè)這種微針與材料表面上的分子之間的相互作用。我們能夠達(dá)到與傳統(tǒng)的AFM一樣的觀察細(xì)節(jié)，但是能夠比后者快一千倍地處理材料。高速AFM非常適合于一些醫(yī)學(xué)應(yīng)用，這是因?yàn)樗軌蚩焖俚靥幚聿牧?，并且提供比同類的成像方法高上百倍的分辨率?rdquo;

提高AFM的速度僅是Reed和他的同事們必須克服的一個(gè)障礙。為了真正地鑒定出DNA中的基因突變，他們必須開發(fā)出一種將標(biāo)志物或標(biāo)簽放置在DNA分子表面上的方法，這樣他們就能夠識(shí)別出這些分子中的模式和不規(guī)則性。他們還利用CRISPR技術(shù)開發(fā)出一種巧妙的化學(xué)條形碼方法。

最近因在基因編輯方面取得的進(jìn)展，CRISPR/Cas9系統(tǒng)成為了很多新聞報(bào)道的頭條?？茖W(xué)家們利用向?qū)NA對(duì)酶Cas9進(jìn)行“編程”，從而在準(zhǔn)確的位點(diǎn)上切割DNA，隨后細(xì)胞能夠自我修復(fù)這種DNA損傷。Reed團(tuán)隊(duì)改變這種酶的化學(xué)反應(yīng)條件以至于它僅結(jié)合到DNA上，但并不切割它。

Reed說(shuō)，“鑒于Cas9是一種在物理上比DNA分子更大的蛋白，它對(duì)這種條形碼應(yīng)用來(lái)說(shuō)是非常完美的。我們驚訝地發(fā)現(xiàn)它結(jié)合到DNA分子上的效率接近90%。而且因?yàn)橛^察Cas9是比較容易的，所以你能夠在DNA的模式中發(fā)現(xiàn)基因突變。”

為了證實(shí)這種技術(shù)的有效性，這些研究人員繪制出淋巴瘤患者的淋巴結(jié)活組織樣品中存在的基因易位。這些基因易位在淋巴瘤等血癌中特別普遍，但是也存在于其他的癌癥中。

盡管這種技術(shù)具有很多潛在的用途，但是Reed和他的團(tuán)隊(duì)正在專注于醫(yī)學(xué)應(yīng)用。他們當(dāng)前正在基于現(xiàn)存的算法開發(fā)軟件以便能夠分析長(zhǎng)一百萬(wàn)個(gè)堿基對(duì)及以上的DNA片段中的模式。一旦開發(fā)完成，就不難想象在病理實(shí)驗(yàn)室中，這種鞋盒大小的儀器就有助診斷和治療與基因突變相關(guān)的疾病。