新奇的光電生物傳感器SiPM

　　傳感器變送與應(yīng)用

　　很多種生物應(yīng)用都涉及熒光技術(shù)。特別是在DNA-Chip光學(xué)檢測(cè)中，熒光團(tuán)與靶分子(待測(cè)分子)結(jié)合，再與探針(錨定在玻片上的一個(gè)DNA鏈)雜交，然后使用光學(xué)掃描儀檢測(cè)DNA.本文的目的是推薦使用一個(gè)新奇的傳感器替代傳統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)，該傳感器基于硅光電倍增管或SiPM,即將若干個(gè)固態(tài)光電檢測(cè)器排成像素陣列;另一個(gè)目的是研究新型熒光染料。硅光電倍增管由像素?cái)?shù)量不同(25-400個(gè)像素)的陣列組成，用于在各種溶液中檢測(cè)CY5和Ru(bpy)32+染料的熒光，為硅光電倍增管在DNA-Chip測(cè)量中的應(yīng)用創(chuàng)造了機(jī)會(huì)。

　　1. 前言

　　硅光電倍增管(SiPM)是一種創(chuàng)新的Geiger模式的固態(tài)光電檢測(cè)器。硅光電倍增管結(jié)構(gòu)是若干個(gè)相等的單個(gè)像素并排組成的陣列，每個(gè)像素都是一個(gè)集成降壓電阻的硅p-n結(jié)雪崩光電二極管(SPAD) [1]。所有像素都并聯(lián)至一個(gè)統(tǒng)一的輸出點(diǎn)，因此，輸出信號(hào)是各個(gè)像素產(chǎn)生的信號(hào)的總合，并與光子碰撞的單元數(shù)量成正比[2]。硅光電倍增管是一個(gè)很有前景的光電檢測(cè)解決方案，可代替?zhèn)鹘y(tǒng)光電倍增管(PMT)，該技術(shù)的某些特性引起人們的興趣，例如，對(duì)磁場(chǎng)不敏感的特性使之適用于強(qiáng)磁場(chǎng)工作環(huán)境;穩(wěn)健性和可靠性高于傳統(tǒng)光電倍增管;工作電壓更低，價(jià)格更便宜，反應(yīng)速度更快，尺寸更小。高速[3]、高靈敏度和小尺寸讓硅光電倍增管成為最佳的便攜應(yīng)用光電檢測(cè)器。當(dāng)然，在各種應(yīng)用領(lǐng)域，生物傳感器是最令人期待的目標(biāo)應(yīng)用，不過(guò)，作為熒光檢測(cè)器，硅光電倍增管被推薦用于生物傳感器的文獻(xiàn)并不是很多[4-5]。基于DNA-Chip的解決方案通過(guò)熒光測(cè)量方法同時(shí)測(cè)定大量基因的表達(dá)量[6]。CY3和CY5(發(fā)射波長(zhǎng)分別為570 nm和670 nm)是標(biāo)記DNA目標(biāo)的傳統(tǒng)熒光團(tuán)。

　　本文探討了CY5參考標(biāo)記熒光團(tuán)和Ru(bpy)32+創(chuàng)新熒光團(tuán)。其中，Ru(bpy)32的某些獨(dú)有特性使其可以替代傳統(tǒng)熒光團(tuán)，成為新的備用熒光團(tuán)。事實(shí)上，該熒光團(tuán)的最大吸收波長(zhǎng)和最大發(fā)射波長(zhǎng)分別為450 nm (金屬配體轉(zhuǎn)移)和630 nm [7],這一間隔范圍可簡(jiǎn)化熒光檢測(cè)器設(shè)計(jì)，準(zhǔn)許使用價(jià)格低廉的低功率LED管代替昂貴的激光管。而且，該熒光團(tuán)壽命比CY5更長(zhǎng)(360 ns對(duì)1÷3ns)，我們?cè)俅谓ㄗh光源使用LED (壽命比激光器更長(zhǎng))。最后，在系統(tǒng)集成方面，信號(hào)控制電路設(shè)計(jì)可能變得更簡(jiǎn)單。

　　有很多問(wèn)題能影響集成光電檢測(cè)系統(tǒng)的實(shí)現(xiàn)，為發(fā)現(xiàn)所有的問(wèn)題，本文設(shè)定一個(gè)雙重探討目標(biāo)：將熒光團(tuán)作為溶液參數(shù)(鹽水與染料溶液的濃度)加以研究;探討硅光電倍增管在測(cè)量生物樣本熒光過(guò)程中的性能表現(xiàn)。

　　2. 實(shí)驗(yàn)儀器工具

　　A.待測(cè)產(chǎn)品描述

　　本文中的被測(cè)硅光電倍增管是意法半導(dǎo)體卡塔尼亞(意大利)研發(fā)中心研制的多片光電檢測(cè)解決方案[2].該多片方案共有7個(gè)光電檢測(cè)器，其中像素?cái)?shù)量從1個(gè)到400個(gè)。具體地說(shuō)，單像素檢測(cè)器(圖1g)1個(gè)，而25像素(圖1:a和 d)、100像素(圖1:b和 e)和400像素(圖1:c和 f)點(diǎn)陣式檢測(cè)器各有兩個(gè)，(按尺寸劃分)分為有光溝槽和無(wú)光溝槽兩類[8]。為了對(duì)所選器件施加偏壓，采集輸出信號(hào)，多片光電倍增管被焊接到一個(gè)敞開(kāi)的32引腳封裝內(nèi)。

　　圖1:多片光電倍增管結(jié)構(gòu)圖，其中a、b、c和d、e、f分別代表 5×5、 10×10、20×20像素有溝槽和無(wú)溝槽光電檢測(cè)器;g是單像素光電檢測(cè)器。

　　B.樣品制備

　　將CY5 (取自iCycler iQ Calibrator Dye Solution Set #170-8792, Bio-rad) 和 100μg/ml Ru(bpy)32+置于三種不同的溶濟(jì)中： H2O milliQ、PBS (磷酸鹽緩沖鹽水) 0.1 M和 PBS 0.01 M.。CY5被稀釋成30%和40%兩種濃度。PBS是一種用NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4制成的鹽水溶液。若需要，加適量稀鹽酸(HCl)或氫氧化鈉(NaOH)，將pH值調(diào)到7.2。PBS用于測(cè)試鹽的存在對(duì)染料熒光的影響，我們發(fā)現(xiàn)，在黑暗條件下，取每種溶液2 μl,置于玻片(選擇玻片的原因是其厚度為0.13-0.16 mm)上，形成直徑幾毫米的液滴。將玻片樣品置于干燥器內(nèi)，風(fēng)干30分鐘(30‘)。

　　C.測(cè)量?jī)x器

　　我們用下面圖2所示的儀器工具測(cè)定樣品發(fā)射的熒光信號(hào)。激光二極管(相干立方體激光器) 負(fù)責(zé)發(fā)射光線，PC機(jī)控制發(fā)射光。發(fā)射光在撞擊樣本前，被濾波器衰減30 dB。我們使用兩個(gè)660 nm 或403 nm波長(zhǎng)的激光二極管分別激發(fā)CY5和Ru(bpy)32+.測(cè)定照射樣品的激光的功率，該功率是電激光二極管功率的一個(gè)函數(shù)。當(dāng)電激光功率在10-80 mW 時(shí)，照射樣品的激光的功率在11-113 μW之間。

　　圖2:測(cè)量?jī)x器工具

　　硅光電倍增管設(shè)為連續(xù)工作模式，并連至Keithley 236源測(cè)量?jī)x，將硅光電倍增管置于角度計(jì)上，以便讓操作人員能夠觀察不同發(fā)射角的熒光信號(hào)。樣本置于激光二極管的同一光軸上，光線正常照射樣本表面。將硅光電倍增管用作光子計(jì)數(shù)器，使用脈沖工作模式檢測(cè)非常微弱的熒光信號(hào)。用安捷倫脈沖發(fā)生器Agilent 81110A驅(qū)動(dòng)激光二極管取得的脈沖激光波形(周期10ms,波長(zhǎng)4 ns)測(cè)量CY5樣本發(fā)射的光子。在這種情況下，同樣讓激光正常照射置于同一光軸上的樣本，將硅光電倍增管與激光二極管置于同一平面上，且與激光管光軸的夾角為60°，用硅光電倍增管檢測(cè)樣本發(fā)射的熒光。該指定角度可確保被檢測(cè)到的光噪聲 (玻片反射的激光) 最低。向硅光電倍增管施加-30V或 -32V偏壓。若需要更高的信號(hào)強(qiáng)度，則施加更高的偏壓。用示波儀(Tektronix DPO7104)記錄檢測(cè)到的信號(hào)，通過(guò)專門開(kāi)發(fā)的Labview軟件采集信號(hào)，在PC機(jī)上使用Matlab軟件對(duì)信號(hào)進(jìn)行后分析。[!--empirenews.page--]

　　3. 測(cè)試結(jié)果與分析討論

　　A. 器件定性分析

　　該多片方案內(nèi)的光電檢測(cè)器全都具有光電特性[9].我們的目標(biāo)是確定最佳的信噪比[10],測(cè)量了該器件的反向電流-電壓 (I-V)特性和暗計(jì)數(shù)數(shù)量(DC)，即在無(wú)光照條件下由被檢測(cè)到的熱生成載波引發(fā)的雪崩(計(jì)數(shù))。圖3a所示是5×5 (綠線)、10×10 (藍(lán)線)、20×20 (紅線)像素點(diǎn)陣有溝槽光電檢測(cè)器在室溫條件下的典型反向I-V特性。圖3b所示是暗計(jì)數(shù)測(cè)量結(jié)果，暗計(jì)數(shù)測(cè)量就是對(duì)硅光電倍增管施加-30V偏壓，然后通過(guò)歸一化計(jì)算取得的像素?cái)?shù)量。通過(guò)直接比較不同陣列，我們發(fā)現(xiàn)兩個(gè)明顯的主要特性：所有測(cè)試條件中擊穿電壓(BV)相同，如果像素?cái)?shù)量增加，則器件噪聲(暗電流和暗計(jì)數(shù))隨之提高[8]。BV (-28V)和 -35 V區(qū)間是Geiger模式工作的目標(biāo)范圍。在這個(gè)區(qū)間，暗電流隨著像素?cái)?shù)量增加而線性提高，這種現(xiàn)象在圖3b第一個(gè)區(qū)間 (0.5 #p.e.)更為明顯 。

　　圖3 (a) 25像素 (綠線)、100像素 (藍(lán)線)、400像素 (紅線)有溝槽硅光電倍增管的反向 I-V特性; (b) 25像素 (綠線)、100像素 (藍(lán)線)、400像素 (紅線)有溝槽硅光電倍增管的暗計(jì)數(shù)特性

　　當(dāng)只有一個(gè)單元計(jì)數(shù)時(shí)，所有器件的暗計(jì)數(shù)相同，這證明反向電流的上升呈線性。在圖3b的第2區(qū)間(1.5 #p.e.)，硅光電倍增管的三個(gè)器件呈現(xiàn)不同的特性，兩個(gè)像素光電檢測(cè)器同失效，5×5像素有光溝槽器件是硅光電倍增管中暗計(jì)數(shù)最少的光電檢測(cè)器，這表示其串?dāng)_概率最低，因此信噪比最高。這個(gè)結(jié)果讓我們將25像素光電檢測(cè)器定義為最符合我們目標(biāo)的器件。

　　B. 樣品定性分析

　　為研究熒光特性和生物傳感器性能，我們采取了多種測(cè)量方法(見(jiàn)實(shí)驗(yàn))。圖4描述了在室溫時(shí)兩個(gè)熒光染料在20°-90°位置的熒光特性。值得一提的是，圖中電流值是熒光信號(hào)電流減去參考樣品(玻片)電流測(cè)量值的凈電流。圖4還描述了兩種不同濃度的CY5溶液(圖4a)和Ru(bpy)32+ (圖 4b)的熒光特性。硅光電倍增管偏壓為-30V,激光功率為72μW.在測(cè)試分析中，出現(xiàn)了一些值得注意的結(jié)果：CY5濃度增加導(dǎo)致熒光電流測(cè)量值增加，信號(hào)值在兩種熒光團(tuán)的滿量程內(nèi)基本上是常數(shù)，證明熒光信號(hào)的各向同性發(fā)射特性[11]; milliQ水溶液是確保熒光凈電流(圖中沒(méi)有顯示)最大的最佳溶液。若想解釋Ru(bpy)32+是熒光團(tuán)溶液濃度的函數(shù)，還需要進(jìn)一步研究探索。最后，我們用H2O milliQ水溶液制成濃度30%的CY5溶液，然后用硅光電倍增管的光子計(jì)數(shù)工作模式，測(cè)量該樣品發(fā)射的光子數(shù)量。這個(gè)測(cè)量過(guò)程分為兩個(gè)步驟：在硅光電倍增管上施加-32V偏壓，分析參考樣品(頂部無(wú)CY5沉淀物)和 CY5樣品。在第一種情況中，示波器采集的信號(hào)是硅光電倍增管的固有噪聲和玻片反射的激光輻射產(chǎn)生的殘余噪聲(在這種工作條件下非常低)。然后，我們將CY5沉淀樣品置于激光二極管的同一光軸上，在示波器屏幕上，進(jìn)入連續(xù)模式，可以看到不同振幅的信號(hào)，因?yàn)槠骄?個(gè)像素被光子射中。圖5詳細(xì)描述了捕獲的數(shù)據(jù)。具體地說(shuō)，藍(lán)實(shí)線表示發(fā)射光子的分布，而紅實(shí)線則表示從參考樣品捕獲的噪聲。多達(dá)6個(gè)光子照射傳感器工作區(qū)，在光電頻譜中測(cè)量到的熒光峰值間隔代表一個(gè)像素提供的電量。硅光電倍增管增益(G) 為輸出電荷Qto與被檢測(cè)到的光子nph和電子電荷(q)的比值：

　　G=Qtot/nph·q ---------- (1)

　　假設(shè)平均一個(gè)光子引發(fā)一個(gè)像素雪崩，則增益的表達(dá)式如下：

　　G=Qpixel/q= CD ·(VBIAS - VBD) /q ---------- (2)

　　由于在-32V偏壓下，CD 通常是在 10 - 100 fF范圍內(nèi)，所以，假設(shè)nph=1,VBD = -28V,單個(gè)光電頻譜內(nèi)的峰值間隔測(cè)量值大約是3.50·10-13,對(duì)應(yīng)的增益值為2.2·106.不過(guò)，當(dāng)硅光電增管偏壓上升時(shí)，記錄的增益和噪聲測(cè)量值都會(huì)提高，為確保最佳的信噪比，我們必須找到一個(gè)折衷的解決方案。因?yàn)镃Y5吸收波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)十分拉近(分別為650 nm和670 nm)，所以集成化檢測(cè)器難以實(shí)現(xiàn)。熒光壽命短暫(1÷3ns)需要實(shí)現(xiàn)更加復(fù)雜的控制和管理電路。另一方面，可以選用一個(gè)不同的熒光染料，例如，Ru(bpy)32+,因?yàn)槲蘸桶l(fā)射峰值之間的巨大差距(分別為450 nm和630 nmy)和長(zhǎng)壽命(大約360 ns)，該新型染料讓人們能夠降低對(duì)光學(xué)和電子器件的工作條件的要求。

　　圖4(a) 30% CY5溶液(藍(lán)線)和40% CY5溶液(紅線) 在20°- 90°位置的熒光特性; (b) 700μg/ml Ru(bpy)32+(綠線)溶液在20°- 90°位置的熒光特性

　　圖5:CY5熒光光子計(jì)數(shù)分布(藍(lán)線)，噪聲(紅線)

　　4. 結(jié)論

　　在本文中，意法半導(dǎo)體卡塔尼亞研發(fā)中心研制的硅光電倍增管可檢測(cè)生物樣本發(fā)射的弱熒光，用于研制易用的生化光學(xué)系統(tǒng)。此外，我們優(yōu)化的生物傳感器方案可讓設(shè)備廠商研制非常緊湊的便攜光電系統(tǒng)。

　　通過(guò)多片產(chǎn)品定性分析，我們確定5×5像素有光溝槽的光電檢測(cè)器的暗計(jì)數(shù)和串?dāng)_概率最低，最適合我們的應(yīng)用要求。脈沖式測(cè)量方法的結(jié)果證明，硅光電倍增管可用作光子計(jì)數(shù)器，還用于生物感測(cè)設(shè)備。硅光電倍增管和u(bpy)32+ 創(chuàng)新染料的特性讓我們能夠最大限度縮減器件尺寸，為片上實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用創(chuàng)造機(jī)會(huì)。